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C. Faraj,¹ E. Adlaoui,¹ C. Brengues,² D. Fontenille² et M. Lyagoubi¹

مقاومة الأنوفيلة المتفرعة للد.د.ت في المغرب: التعرف على الآليات واختيار المبيدات الحشرية البديلة

شفيقة فراج، البشير العدلاوي، سيسيل برانكس، ديديي فونتوني، محمد اليعقوبي

الخلاصـة: أجريت هذه الدراسة للتعرف على مقاومة الأنوفيلة المتفرعة، وهي ناقلة الملاريا في المغرب، في ولايات القنيطرة، وخوربجه ولعراش والخميسات وسَلاَ خلال عام 2005. وقد كانت الأنوفيلية المتفرعة حسَّاسة للبروبوكسور والفينيتـروثيون والبيرميثرين، ومقاوِمة لمختلف تركيزات الد.د.ت. أما من الناحية الجينية، فلم يكن هناك تغير في الهدف المشتـرك الذي يستهدفه الد.د.ت والبيريتـرونيدات، وهو قناة الصوديوم المعتمدة على الفولطاج. ويبدو أن المقاومة ناجمة عن آليات إزالة السمية الخاصة بالد.د.ت. فلا مانع من حيث المبدأ، من إحلال مركبات البيريتـرونيدات محل الد.د.ت في المغرب. ويمكن عند ذلك كشف المقاومة ومراقبتها باستخدام أدوات جزيئية موثوقة في مختبر الحشرات الطبية في المعهد الوطني للصحة.

RÉSUMÉ: Une étude de la résistance d’Anopheles labranchiae, vecteur du paludisme au Maroc, a été réalisée au niveau des provinces de Kénitra, Khouribga, Larache, Khémisset et Salé au cours de l’année 2005. An. labranchiae est sensible au propoxur, au fénitrothion et à la perméthrine, et résistant à des degrés divers au DDT. L’étude génétique de cette résistance n’a pas révélé l’existence de modification de la cible commune au DDT et aux pyréthrinoïdes, qui est le canal sodium voltage dépendant. Cette résistance semble être due à des mécanismes métaboliques spécifiques au DDT. Elle ne devrait, en principe, constituer aucun obstacle à la substitution du DDT par les pyréthrinoïdes au Maroc. La résistance peut désormais être détectée et surveillée par des outils moléculaires plus fiables au niveau du Laboratoire d’Entomologie médicale (LEM) de l’Institut national d’Hygiène.

Resistance of Anopheles labranchiae to DDT in Morocco : identification of the mechanisms and choice of replacement insecticide

ABSTRACT: A study of Anopheles labranchiae resistance in Morocco was conducted in the provinces of Kénitra, Khouribga, Larache, Khémisset and Salé during 2005. An. labranchiae was susceptible to propoxur, fenitrothion and permethrin and resistant to varying degrees to DDT. Genetically there was no change to the target site common to DDT and pyrethroids, the voltage gated sodium channel. The resistance seemed to be due to detoxification mechanisms specific to DDT. In principle, there should be no obstacle to the substitution of DDT by pyrethroids in Morocco. Resistance can then be detected and supervised by more reliable molecular tools in the Laboratory of Medical Entomology of the National Institute of Hygiene.

¹Laboratoire d’Entomologie médicale, Département de Parasitologie, Institut national d’Hygiène, Rabat (Maroc) (Correspondance à adresser à C. Faraj : This e-mail address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it ).
²Laboratoire de Lutte contre les Insectes nuisibles, Institut de Recherche pour le Développement (IRD), Montpellier (France).
Reçu : 18/06/06 ; accepté : 27/09/06
EMHJ, 2008, 14(4):776-783

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Introduction

La lutte contre An. labranchiae, vecteur du paludisme au Maroc, repose essentiel-lement sur l’utilisation du DDT en aspersion intradomiciliaire comme adulticide et du téméphos comme larvicide. La dernière utilisation du DTT comme adulticide date de 2001 dans les foyers résiduels du Rif.

La sensibilité de l’espèce à ces insectici-des est régulièrement surveillée. Les pre-miers tests de sensibilité au DDT réalisés en 1959 montrèrent une sensibilité normale de l’espèce à cet organochloré au Maroc [1]. À partir de 1971, les premiers cas de résistance furent observés [1, J. De Zulueta, C.D. Rams-dale, rapport inédit, 1973]. Depuis, des taux de résistance atteignant jusqu’à 30 % ont été observés dans différentes régions du pays, aussi bien dans des zones sous aspersions que dans des zones qui n’ont pas connu de traitement depuis des vingtaines d’années [L.F. Delfini, G.R. Shidrawi, rap-port inédit, 1989]. Actuellement, la stratégie du Programme de Lutte antipaludique est orientée vers d’autres issues basées sur l’aménagement de l’environnement, la lutte biologique et la recherche d’insecticides de remplacement au DDT [2]. Toutefois, il n’y a aucune information sur l’état de sensibilité d’An. labranchiae aux autres insecticides : organophosphorés, carbamates et pyréthrinoïdes. Les mécanismes impliqués dans la résistance d’An. labranchiae au DDT ne sont pas non plus encore identifiés. Il semble primordial, avant d’envisager l’utilisation d’autres insecticides, d’iden-tifier, d’une part, les mécanismes mis en jeu dans la résistance d’An. labranchiae au DDT et d’autre part, de connaître la sensibilité de ce vecteur à ces autres pro-duits. En fait, deux mécanismes impliqués dans la résistance des anophèles au DDT sont, jusqu’à maintenant, mis en évidence : une résistance métabolique qui correspond à une dégradation de l’insecticide par des enzymes, glutathion S-transférases (GST), ou une modification de la cible, mutation du gène canal sodium voltage dépendant (kdr) [3]. Le GST est un mécanisme spécifique au DDT ; son implication n’entrave pas l’utilisation des pyréthrinoïdes comme insecticides de remplacement au DDT. Par contre, l’implication du gène kdr n’entraîne pas uniquement la résistance au DDT mais aussi à la majorité, sinon à la totalité des pyréthrinoïdes utilisés en santé publique [4,5]. En Turquie où des résistances multi-ples existent chez An. sacharovi, espèce très proche d’An. labranchiae puisqu’elles appartiennent au même complexe, le kdr a déjà été mis en évidence [6].

La présente étude a pour objectifs d’étudier l’état de sensibilité d’An. labranchiae aux différents insecticides utilisés en santé publique, d’identifier les mécanismes impliqués dans la résistance au DDT au Maroc et d’orienter le choix d’un insecticide de remplacement.

Méthodes

Zone d’étude

Les anophèles utilisés dans cette étude ont été prélevés dans des zones agricoles soumises à des traitements chimiques et où différents taux de résistance au DDT ont été enregistrés. Cinq provinces ont été ainsi retenues : Kénitra, Khémisset, Larache, Khouribga et Salé (Figure 1). Avant d’être soumis aux tests de sensibilité, les anophèles, capturés par aspirateur à bouche dans des abris animaux, ont été identifiés morphologiquement (An. maculipennis s.l.) [7]. Les survivants aux tests ont été identifiés par amplification génique (PCR) [8].

Tests biologiques

L’état de sensibilité d’An. maculipennis s.l. a été déterminé vis-à-vis de quatre insectici-des : DDT 4 %, fénitrothion 1 %, propoxur 0,1 % et perméthrine 0,75 %. Les tests ont été pratiqués sur des femelles sauvages du complexe An. maculipennis selon la méthode normalisée par l’OMS [9]. Cette méthode consiste à exposer les moustiques à des papiers imprégnés d’insecticides à la concentration diagnostique. Les tests ont été réalisés sur des lots de 20 à 25 femelles gorgées dans des tubes OMS avec 3 à 4 répétitions par insecticide. Pour chaque test, deux tubes tapissés de papiers imprégnés uniquement d’huile minérale ont servi de témoins. Le temps d’exposition est de 60 mn. Après exposition, les moustiques sont maintenus sous observation pendant 24 heures à une température d’environ 25 °C et une humidité relative d’environ 70 % avant de noter la mortalité. Pour les tests à la perméthrine, le pourcentage de moustiques « knock-down » a été noté au cours de l’exposition. L’évolution de ce pourcentage a été analysée selon un modèle log probit afin de déterminer les temps de « knock-down », KDT50 et KDT90. Tous les survivants aux doses discriminatoires ont été conservés à - 80 °C avant d’être soumis à des analyses moléculaires.

Identification moléculaire des espèces

L’identification moléculaire des spécimens An. maculipennis s.l. a été faite selon la technique décrite par Proft et al. [8]. Elle est basée sur l’amplification de la région « Second Internal Transcribed Spacer » ou ITS2 et utilise, en combinaison, un primer universel et des primers spécifiques permettant de différencier six parmi les sept espèces du complexe An. maculipennis s.l. : An. atroparvus, An. labranchiae, An. maculipennis s.s., An. melanoon, An. messeae et An. sacharovi.

Recherche de la mutation du gène kdr

Il n’existe pas encore à ce jour de test diagnostique permettant la mise en évidence d’une mutation de type kdr chez An. labranchiae, comme il en existe chez An. gambiae [3] ou C. pipiens [10]. La recherche d’une éventuelle mutation dans la zone codant pour le canal sodium voltage dépendant chez An. labranchiae se fait par séquençage, après amplification de cette zone. Cette recherche a été effectuée au Laboratoire de Lutte contre les Insectes nuisibles (LIN), Institut de Recherche pour le Développement (IRD), Montpellier (technique non publiée). Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences du canal sodium voltage dépendant d’An. sacharovi [6].

Résultats

Au niveau de chaque province, les tests ont été réalisés par ordre de priorité, en fonction de la densité d’adultes d’An. labranchiae, au DDT (4 %), à la perméthrine (0,75 %), au propoxur (0,1 %) et au fénitrothion (1 %). Les populations testées sont totalement sensi-bles au propoxur et à la perméthrine avec des KDT50 et KDT90 variant respectivement autour de 15 et 35 mn (Tableau 1). Les taux de résistance au DDT sont variables selon les provinces. Dans la province de Larache, on enregistre des taux de résistance de 19 et 22 %, respectivement, pour les localités de Boucharen et Louamra. Dans la localité de Ouled Moussa, province de Kénitra, le taux de résistance au DDT est de 19 % alors que 5 % de cette même population a survécu au fénitrothion. Dans la province de Khouribga, localité de Béni Khlef, le taux de résistance au DDT est de 25 %. Dans la localité de Chougaga, province de Khémisset, 10 % de la population testée a survécu à la dose discriminatoire du DDT ; 2 % de cette même population a survécu à la dose discriminatoire du fénitrothion. Dans la localité de Ouled Bourzine, préfecture de Salé, la mortalité notée après l’exposition au DDT est de 85 %.

Les tailles des bandes de migration des produits d’amplification de la région ITS2 révélées sur gel d’agarose ont été comparées à celles du témoin du complexe An. maculipennis et du marqueur de taille (100-1000 pb). La taille des bandes obtenues est de 375 pb, similaire à celle du témoin An. labranchiae. An. labranchiae est donc la seule espèce du complexe An. maculipennis s.l. retrouvée parmi les spécimens survi-vants testés. Ces résultats concordent avec ce qui est déjà rapporté sur la composition du complexe An. maculipennis s.l. au Maroc [11].

Le séquençage des produits d’ampli-fication chez les spécimens ayant survécu à l’exposition au DDT n’a pas révélé de différence au niveau du gène canal sodium voltage dépendant par rapport à des spécimens d’An. sacharovi sensibles. Il n’y a donc pas de mutation de type kdr chez les spécimens testés. Ces résultats donnent à penser que les mécanismes impliqués dans la résistance d’An. labranchiae au DDT sont vraisemblablement de nature biochimique.

Discussion

D’après les résultats des tests biologiques réalisés au niveau des différentes zones étudiées, An. labranchiae est sensible à la perméthrine, au propoxur et au fénitrothion (Tableau 1). Il présente une résistance faible à modérée au DDT. Les taux de résistance au DDT varient de 10 à 25 % selon les régions. La souche de Khouribga semble être la plus résistante, celle de Salé la plus sensible. Cette résistance semble être maintenue malgré l’arrêt des traitements au DDT. Les premiers cas de résistance ont été détectés en 1971 dans les provinces de Kénitra, Khouribga et El Jadida [1], soit une dizaine d’années après les premières utilisations du DDT en santé publique. Par la suite, plusieurs enquêtes entomologiques ont montré la présence de cette résistance dans d’autres régions. En 1973, des contacts de 2 et 4 heures avec des papiers imprégnés au DDT (4 %) n’ont entraîné respectivement que 83 % et 91 % de mortalité chez An. labranchiae dans le secteur de Louamra (province de Larache). Ce constat a incité De Zulueta et Ramsdale à s’inquiéter quant à une éventuelle progression et généralisation de la résistance au DDT, comme c’était le cas en Turquie. Dix ans plus tard, J.L. Clarke [rapport inédit] a obtenu des taux de mortalité similaires (87 % après une exposition de 2 heures) dans la localité de Lyadiya (province de Kénitra). Des taux comparables ont été obtenus par Delfini en 1989 dans la province de Fès qui n’a pas été traitée au DDT depuis 1971 (77 % et 86 % respectivement après 1 et 2 heures de contact). Le même auteur a observé le même taux de résistance dans la province de Meknès (89 % de mortalité après 2 heures d’exposition). Nous-mêmes avons enregistré, dans le cadre du Programme national de Lutte antipaludique, des taux de résistance semblables au cours des 10 dernières années dans différentes provinces du pays.

Les derniers traitements au DDT en san-té publique dans les provinces de Salé et Kénitra ont eu lieu il y a plus de 25 années, alors qu’ils ont été interdits en agriculture dans les années 1970. Au niveau des provin-ces de Larache, Khémisset et Khouribga, ceux-ci ont eu lieu il y a respectivement 17, 11 et 5 ans. Le maintien d’une faible résistance apparente après l’arrêt des aspersions laisse supposer l’existence d’une pression de sélection exercée par d’autres insecticides qui sont toujours en cours d’utilisation, tels que les pyréthrinoïdes largement utilisés en agriculture.

La résistance d’An. labranchiae aux pyréthrinoïdes, aux carbamates, aux organochlorés et aux organophosphorés est mal documentée au Maroc. La sensibilité aux organophosphorés n’est approchée qu’à travers les tests de sensibilité des larves au téméphos. Celles-ci sont, en fait, toujours sensibles à ce produit (données non publiées du Laboratoire d'Entomologie médicale - LEM) malgré son utilisation, dans le cadre du Programme national de Lutte antipaludique, comme seul insecticide dans la lutte antilarvaire depuis les années soixante-dix. Les résultats de notre étude concernant la sensibilité au fénitrothion à 1 % concordent avec ces données. Quant à la sensibilité aux pyréthrinoïdes, le seul test concernant la lambdacyhalothrine 0,1 %, réalisé dans la province de Kénitra [2], montre une sensibilité normale de l’espèce à ce produit (98 % de mortalité après une heure de contact). Toutefois, il faut signaler que la dose de lambdacyhalothrine utilisée (0,1 %) est deux fois la dose diagnostique utilisée pour An. gambiae (0,05 %) [5]. Nos résultats actuels avec la perméthrine à 0,75 % peu-vent être aussi discutés puisque cette dose n’a jamais été testée pour An. labranchiae.  Chandre [5] a réévalué ces doses pour An. gambiae à 1 % pour la perméthrine et 0,05 % pour la lambdacyhalothrine. Idéalement, la dose diagnostique devrait être établie pour chaque espèce et chaque insecticide. Toutefois, en tenant compte de l’effet « knock-down » observé au cours de l’exposition des femelles à la perméthrine, et de la mortalité de 100 % après 24 heures, nous pensons pouvoir conclure à une sensibilité normale d’An. labranchiae aux pyréthrinoïdes. Les taux de KDT50 et KDT90 variaient respectivement autour de 15 et 35 mn. Des résultats similaires ont été obtenus chez des souches sensibles d’An. gambiae homozygotes et hétérozygotes pour le gène kdr [5]. D'après le même auteur, la baisse de l’effet « knock-down » peut être considérée comme un indicateur précoce de l’apparition de la résistance car elle peut être significative avant même que l’on observe une baisse de mortalité. Celle-ci n’est en fait obtenue par les tests OMS que lorsque la population est constituée d’une proportion importante d’homozygotes pour le gène de résistance. Afin de confirmer la probable non-implication d’une mutation sur le gène kdr, nous avons recherché une éventuelle mutation de ce gène. Le test diagnostique du gène kdr permettrait l’identification de la mutation de ce gène chez les individus hétérozygotes, d’où une détection précoce de l’apparition de la résistance [5].

Le séquençage de la région du canal sodium voltage dépendant susceptible de présenter une mutation de type kdr et la comparaison avec celle d’An. sacharovi sensible n’a pas permis de mettre en évidence une quelconque mutation qui pourrait être impliquée dans la résistance au DDT observée chez An. labranchiae. Ces données indiquent que la baisse de sensibilité au DDT n’est pas due à une modification du canal sodium voltage dépendant, cible commune au DDT et aux pyréthrinoïdes.

Ces derniers constitueraient donc l’alternative idéale pour remplacer le DDT au Maroc tout en surveillant de près la sensibilité du vecteur vis-à-vis de ces produits. La détection précoce d’une mutation de ce gène contribuera sans aucun doute à la mise au point de stratégies de lutte permettant de mieux maîtriser ce phénomène de résistance. L’absence de mutation du gène kdr chez les individus qui ont survécu à la dose discriminatoire du DDT suppose l’implication de mécanismes de détoxication spécifiques à ce produit.

Conclusion

À travers cette étude nous avons confirmé, par l’utilisation du test OMS, la présence de la résistance d’An. labranchiae au DDT à des degrés divers et sa sensibilité à la perméthrine, au propoxur et au fénitrothion dans les provinces de Kénitra, Larache, Khouribga, Khémisset et Salé. Dans toutes ces provinces, les pyréthrinoïdes n’ont jamais été utilisés en santé publique tandis que le DDT l’a été depuis les années soixante et n’a pas été utilisé depuis 1980 dans les provinces de Salé et Kénitra et depuis 1988, 1994, 2000 respectivement dans les provinces de Larache, Khémisset et Khouribga.

Les tests moléculaires ont montré l’absence de mutation du gène kdr. L’utilisation du DDT en santé publique pendant plus de 30 ans et celle des pyréthrinoïdes agricoles depuis plusieurs années n’ont apparemment jamais sélectionné la mutation kdr chez An. labranchiae au Maroc. Les pyréthrinoïdes resteraient, pour le moment, les insecticides de choix pour la substitution du DDT dans la lutte contre le paludisme. La surveillance de la résistance par de nouveaux outils moléculaires est recommandée.

Remerciements

Cette étude a reçu le soutien technique et financier du Bureau régional de l’OMS pour la Méditerranée orientale (EMRO), Division des Maladies transmissibles (DCD), et le Programme spécial UNICEF/PNUD/Banque mondiale/OMS de recher-che et de formation concernant les maladies tropicales (TDR).

Nous tenons à remercier le programme EDEN, GOCE-2003-010284 qui a facilité le déroulement de ce travail. Cet article est référencé EDEN0024. Le contenu de cette publication est sout la seule responsabilité des auteurs et n'engage pas l'Union européenne. Nos vifs remerciements vont également à l’équipe du Laboratoire d’Entomologie médicale : Souad Ouahabi, Mohammed Elkohli, Elhousseine Lakraa et Mohammed Elrhazi pour leur précieuse aide technique sur le terrain et au laboratoire.

Références

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2. Faraj C et al. Étude de l’efficacité de la lambdacyhalothrine, pyréthrinoïde de synthèse, dans la lutte contre Anopheles labranchiae en aspersion intradomici-liaire. Bulletin épidémiologique, 1996, 25:2–8.
3. Martinez-Torres DF et al. Molecular caracterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect molecular biology, 1998, 7:179–84.
4. Darriet F et al. Présence et évolution de la résistance aux pyréthrinoïdes et au DDT chez deux populations d’Anopheles gambiae s.s. d’Afrique de l’Ouest. Genève, Organisation mondiale de la Santé, 1997. (WHO/CTD/VBC/97.1001 et WHO/MAL/97.1081)
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11. Faraj C et al. Note sur le complexe Anopheles maculipennis au Maroc. Bulletin de la Société de Pathologie exotique, 2004, 97(4):293–4.